واسرشتگی اولیه
۱
۹۵
۱۰ ثانیه
واسرشتگی
۵۰
۹۵
۵ ثانیه
اتصال و گسترش
۶۰
۳۴ ثانیه
در این واکنش از رنگ فلورسنت سایبرگیرین استفاده شد.این رنگ فلورسنت به هر DNA دو رشته ای اتصال می یابد و در اثر اتصال نور فلورسنت توسط ردیاب دستگاه آشکار می شود و نتایج را مشخص می کند.فلورسانس حین انجام واکنش PCR و با افزایش تعدادکپی cDNA تا محدود شدن اجزا واکنش افزایش می یابد. از آن پس تعداد کپی cDNA و در نتیجه میزان فلورسنس ثابت می شود.منحنی فلورسانس نشان دهنده تغییرات مذکور است.پس از اتمام PCR،محصولات به دست آمده با افزایش دما ذوب گشته وسپس با کاهش مجدد دما به حالت اولیه (دو رشته ای) در می آیند.تغییرات فلورسانس نمونه ها طی این مرحله در منحنی ذوب نشان داده می شوند تا اطمینان حاصل شود که نتایج به دست آمده مربوط به محصول مورد انتظار است و ناشی از تکثیر محصولات غیر اختصاصی نیست.
۳-۱۴-بررسی میزان بیان ژن گیرنده استروژن آلفا در نمونه های سالم و سرطانی
پس از استخراج RNA و سنتز cDNA از نمونه های بیمار و نرمال،بیان ژن گیرنده استروژن آلفا به وسیله واکنش Real timePCR، مورد ارزیابی قرار گرفت.پس از انجام واکنش، داده های خام به صورت ct از دستگاه استخراج شدواندازه گیری میزان بیان ژن با روشrrCtانجام شد.سپس با بهره گرفتن از نرم افزار Graph pad نمودار بیان ژن رسم گردید.
فصل چهارم
بحث و بررسی داده های تحقیق
۴-۱-نتایج جذب نوری RNA توسط دستگاه اسپکتروفتومتر
نتایج جذب نوری RNA های استخراج شده جهت استفاده در مرحله سنتز cDNA توسط دستگاه اسپکتروفتومتری Eppendorf خوانده شد.در این مرحله نمونه هایی با طول موج ۲۸۰/۲۶۰ نانو مولار با غلظت ۷/۱ تا ۹/۱ مورد تایید بود و برای سنتز استفاده شد.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
۴-۲-منحنی تکثیر
پس از تکثیر cDNA با روش رونویسی معکوس،تستReal time PCR برای۲۰ نمونه بیمار و۱۰ نمونه بافت نرمال انجام شد.در این روش بررسی، نمونه های نرمال جهت مقایسه با نمونه های بیمار استفاده گردید.در حقیقت نمونه نرمال به عنوان نمونه رفرنس برای مقایسه تغییرات در نمونه های بیمار استفاده شد.تست Real time PCR برای هر نمونه سه بار تکرار گردید تا نتایج بدست آمده از صحت و دقت بالایی برخوردار باشد.هم چنین از ژن گلیسر آلدهید ۳ فسفات دهیدروژناز به عنوان کنترل داخلی استفاده گردید.
نمودار منحنی تکثیر (شکل۴-۱) نمونه ها توسط اندازه گیری تغییرات میزان فلورسانس به وسیله دستگاه Real time PCR (ABI 7500) صورت گرفت، که در آن تکثیر نمونه ها نشان داده می شود و تایید کننده افزایش میزان محصول PCR ژن ESR1 مورد نظر می باشد.
شکل(۴-۱) نمودار منحنی تکثیر
۴-۳-نمودار منحنی ذوب
به منظور بررسی اختصاصیت پرایمرها و رنگ فلورسانس ((syber green و اطمینان از تکثیر قطعات اختصاصی و بررسی عدم وجود قطعات غیر اختصاصی در محصول PCR،نمودار منحنی ذوب برای ژنESR1 (شکل۴-۲) و GAPDH (شکل ۴-۳) به صورت جداگانه توسط دستگاه Real time PCR (ABI 7500)رسم گردید،که این امر تاییدی بر اتصال صحیح پرایمرها به ژنESR1 و اختصاصی بودن محصول PCR(دقیقا مربوط به ژن مورد نظر) بود.همچنین برای تایید نهایی،این محصول بر روی ژل آگارز ۵/۱ % مشاهده شد،که محصول اختصاصی تک باند نیز با وزن مولکولی مورد نظر برای این ژن مشاهده گردید.
شکل(۴-۲) نمودار منحنی ذوب تک باند برای ژن ESR1
شکل( ۴-۳)نمودار منحنی ذوب تک باند برای ژن GAPDH
۴-۴- نتایج میزان بیان ژن ESR1
پس از انجام واکنش تکثیر،ct نمونه ها توسط دستگاه محاسبه و به RQ (Relative quantification) یا میزان بیان تبدیل شد و اندازه گیری میزان بیان ژن با روش rrCtانجام شد(جدول ۴-۱). میزان بیان نمونه های بیمار به صورت مقایسه ای با نمونه های نرمال بیان گردید که در واقع نتایج به دست آمده نسبت بیان ژن هدف به میزان بیان همان ژن در بافت نرمال می باشد. RQ نمونه ها از دستگاه برداشته شد و نتایج به دست آمده توسط نرم افزار Graph pad رسم گردید (شکل۴-۴).
جدول( ۴-۱) نتایج بیان ژن افراد بیمار نسبت به افراد نرمال
شماره نمونه
بیان ژن
شماره نمونه
بیان ژن
۱
۳/۲
۱۱
