سیاه سرفه بیماری عفونی باکتریال دستگاه تنفس است که عامل آن بوردتلا پرتوسیس از دسته باکتری های گرم منفی می باشد. در این مطالعه شش بچ از سویه های ۱۳۴ و ۵۰۹ باکتری سیاه سرفه تهیه شده و مورد مقایسه قرار گرفتند. از دو روش فیزیکی سانتریفوژ و میکروفیلتراسیون برای جداسازی سلول باکتری از محیط کشت استفاده گردید. سپس سلول­های جداسازی شده باکتری درPBS خنک و استریل در غلظت متوسط Ou/ml 150-100 حل شده و به دو قسمت تحت نام­های سوسپانسیون سمیت­زدایی با فرمالین (FD) و سوسپانسیون سمیت زدایی با تیومرسال (TD) تقسیم شدند. به سوسپانسیون هایFD بعد از غیرفعال سازی در حرارت ۵۶ درجه سانتیگراد بمدت ۱۰ دقیقهmM 10فرمالین (۷/۳۷ %) اضافه گردید و به سوسپانسیون هایTD در شرایط مشابه، بعد از غیرفعال سازی با حرارت، w/v 01/0 % تیومرسال بصورت محلول اضافه شد. سپس هر دو سوسپانسیون در دمای ۸-۴ درجه سانتیگراد برای سمیت زدایی انکوبه شدند. در روزهای ۱۰، ۳۰، ۹۰، ۱۸۰ و ۲۷۰ از هر دو نوع سوسپانسیون نمونه برداری شد تا سمیت آنها با انجام تست افزایش وزن موش (MWG) مورد ارزیابی قرار گیرد. در نهایت نیز شش واکسن آزمایشی FD وTD از مخلوط کردن غلظت های مشابه دو سویه ۱۳۴ و ۵۰۹ تهیه گردید تا بتوان توانمندی این واکسن ها را در تست حفاظتی موش با تستKendrick ارزیابی نمود. نتایج حاکی از آن بود که روش سمیت زدایی با فرمالین با میانگین دوره ۶/۲۶ روز در مقایسه با روش سمیت زدایی با تیومرسال با میانگین دوره ۱۹۵ روز، روش کوتاهتری از نظر زمانی برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه است. توانمندی واکسن تجربی حاصل از سمیت زدایی با فرمالین با میانگین ۹/۵ از واکسن تجربی حاصل از سمیت زدایی با تیومرسال با میانگین ۹۵/۵ قدری کاهش را نشان داده است. براساس نتایج حاصل، فرمالین با کاهش دوره سمیت زدایی در درجه حرارت ۸-۴ درجه سانتیگراد بمیزان ۵/۷ برابر بسیار مناسب تر از تیومرسال بود. اگرچه توانمندی واکسن حاصل از روش سمیت زدایی با تیومرسال حدود ۰۵/۰ واحد بیشتر از واکسن حاصل از سمیت زدایی با فرمالین است ولی تفاوت از نظر آماری ناچیز بود.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

کلیدواژه­ها: بوردتلاپرتوسیس- سمیت زدایی- تیومرسال- فرمالین- تست افزایش وزن موش (MWG) – تست حفاظتی موش با تست kendrik
فصل اول
کلیات
۱-۱٫ بیان مسأله
بیماری سیاه سرفه یک عفونت تنفسی بوده که توسط باکتری بوردتلا پرتوسیس^[۱] از دسته باکتری­ های گرم منفی ایجاد می شود. نشانه عمده بیماری سرفه هایی است که ممکن است تا چند هفته نیز طول بکشد که مشخصه آن پاروکسیزمال^[۲] شدید با سرفه های ناگهانی است که اغلب خاتمه آن با یک دم همراه می باشد. بیماری در نوزادان و اطفال بیشتر رخ می دهد (۲و۱۸).
در تولید واکسن سلولی سیاه سرفه به روش سنتی و جاری آن در مؤسسه واکسن و سرم سازی رازی جدا سازی باکتری به روش ترسیب با اسیدکلریدریک انجام گرفته و سپس به منظور سمیت زدایی^[۳] توکسین های موجود در سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه از تیومرسال و انکوباسیون درسردخانه به مدت طولانی ۱۲-۹ ماه استفاده می گردد. جدا سازی جرم باکتری با بهره گرفتن از اسید از یک سو و فرایند طولانی سمیت زدایی با مرتیولات از سوی دیگر منجر به کاهش توانمندی واکسن می گردد. لذا در این پروژه با جایگزینی روش های جدا سازی فیزیکی باکتری از محیط کشت بجای روش شیمیایی از یک سو آسیب­های احتمالی به ساختار سلولی باکتری را کاهش داده و از سوی دیگر با بهره گرفتن از فرمالین بجای تیومرسال زمان مورد نیاز برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه به حداقل تقلیل یافت تا ضمن کاهش دوره فرآوری آنتی ژن بتوان فرآورده ای با کیفیت مناسب تر را تولید نمود (۴).
۱-۲٫ تاریخچه­ بیماری سیاه سرفه
اولین شیوع بیماری سیاه سرفه توسط Guillame De Baillou شناخته شد که اپیدمی آن در تابستان ۱۵۷۸ در پاریس اتفاق افتاد (۱۱). بیشترین اثراین اپیدمی بر روی نوزادان و اطفال بود که باعث ایجاد مرگ ­و میر بالایی شد. ظاهراً بیماری قبلاً در فرانسه شناخته شده است، زیرا De Baillou به پنجمین اسم مشترک این بیماری اشاره کرده است. او فرض می کرد بیماری باید به صورت صدای سرفه یا ۵ ساعت تشنج متناوب منعکس شود. یک بیماری از ۱۶ قرن پیش مانندchyne-cough شناخته شده که شاید پرتوسیس بوده باشد و در سال ۱۷۰۱ در لندن مدت ها سیاه سرفه وchyne-cough به صورت مرگ و میر ظهور می کرده است (۱۲). سیدنهام اصطلاح پرتوسیس را به هر بیماری که با سرفه­های شدید همراه بود اطلاق کرد ولی این نام در اواسط قرن هجدهم به بیماری همه گیری محدود شد که ماهیت بالینی مشخص داشت (۲).
بوردت (Bordet) و ژانگو (Gengou) اولین افرادی بودند که باکتری سیاه سرفه را در سال ۱۹۰۶ در آزمایشگاه کشت دادند و چندی بعد واکسن خام بر علیه این باکتری ساخته شد (۲۲).
اولین واکسن سیاه سرفه توسطMedcen در سال ۱۹۳۳ تهیه شد. در این روش سلول های باکتری سیاه سرفه از محیط کشت جدا و سپس با بهره گرفتن از گرما غیر فعال شدند (۶۰).
قبل از استفاده گسترده از واکسن سلولی سیاه سرفه^[۴]، در آمریکا ۲۷۰۰۰۰ مورد بیماری سیاه سرفه هر سال با بیش از ۱۰۰۰۰ مرگ و میر گزارش شده است (۱۱).
وقوع بیماری سیاه سرفه بعد از واکسیناسیون جمعی کودکان در دهه ی ۱۹۴۰ با واکسن سلولی به طور چشمگیری کاهش پیدا کرد و بیشترین کاهش آن در سال ۱۹۷۶ با تعداد ۱۰۱۰ نفر بیمار گزارش شده است (۵۴).
اما از آن به بعد شیوع بیماری دوباره سیر صعودی پیدا کرد که بیشترین افزایش از سال ۱۹۵۹ به بعد بود که بیش از ۲۵۰۰ نفر در سال ۲۰۰۴ به بیماری مبتلا بودند. افزایش این بیماری در آمریکا در بین اطفال و بزرگسالان احتمالاً ناشی از کم­شدن ایمنی القا شده توسط واکسن و همچنین افزایش امتناع از واکسیناسیون در این گروه سنی بوده است. از آنجا که غالباً بیماری سیاه سرفه تشخیص داده نمی­ شود بنابراین تعداد واقعی بیماری از تعداد گزارش شده خیلی بیشتر می باشد. گزارشات سال ۲۰۰۸ هم نشان می­دهد که شیوع این بیماری در نوزادانی که سن آنها به سنی نرسیده که سه دوز از واکسن محتوی سیاه سرفه را دریافت نمایند در حال افزایش می باشد (۱۸).
در طول سال های ۲۰۰۰ الی ۲۰۰۴ بطور متوسط سالانه ۲۴۸۸ مورد از این بیماری در آمریکا گزارش شده که شامل کودکان کمتر از یک سال است که ۶۳% آنها در بیمارستان بستری شده اند (۲۲).
سیاه سرفه در سراسر جهان یک مشکل مهم در کودکان بشمار می آید. سازمان جهانی بهداشت^[۵] (WHO) اعلام کرده است که سالانه در جهان ۴۵ میلیون مورد از این بیماری دیده می شود که از این تعداد ۳۰۱۴۰۸ نفر از کودکان در سال ۲۰۰۲ تلف شده اند (۱۸).
علی رغم اینکه بیش از ۶ دهه از تاریخ واکسیناسیون مدرن می گذرد، سیاه سرفه هنوز هم یکی از رایج ترین بیماری هایی است که توسط واکسن قابل پیشگیری است. گزارش شده است که بیماری سیاه سرفه در برخی از جمعیت های واکسینه شده در سال های ۱۹۸۰ و ۱۹۹۰ دوباره عود داشته است (۸).
یکی از عوامل مهمی که واکسیناسیون نتواند ایمنی کامل ایجاد کند آداپته شدن پاتوژن با سیستم ایمنی و کاهش القای سیستم ایمنی توسط واکسن می باشد (۴۸).
با وجود پوشش بالای واکسیناسیون، بیش از پانزده سال است که بازگشت عفونت سیاه سرفه در سراسر جهان مشاهده می شود. در حالی که بیماری کلاسیک سیاه سرفه در دوران قبل از واکسیناسیون در درجه اول، یک بیماری دوران کودکی بوده، امروزه با واکسیناسیون گسترده، بروز بیماری بیشتر به نوجوانان و بزرگسالان انتقال یافته است.
آمار ارائه شده توسط مراکز کنترل بیماری و پیشگیری^[۶] (CDC) از سال ۲۰۰۴ نشان می دهد موارد بیماری در افراد سنین ۱۹-۱۰ سال بمیزان ۱۹برابر و در افراد بالاتر از ۲۰ سال به ۱۶ برابر افزایش یافته است (۲۲).
در واقع نوجوانان و بزرگسالان نقش قابل توجهی در انتقال سیاه سرفه به نوزادان و کودکانی دارند که نسبت به بروز عوارض بیماری و مرگ و میر ناشی از آن آسیب پذیرتر می باشند.
نمودار ۱-۱ مقایسه تعداد افراد زیر ۱سال ایمن شده با واکسنDTP در سه کشور مختلف در سال ۲۰۰۰ تا ۲۰۱۰
از عوامل متعدد در افزایش بروز بیماری سیاه سرفه می­توان از نقصان عملکرد ایمنی پس از عفونت طبیعی و یا حتی خود واکسیناسیون نام برد. لذا به منظور جلوگیری ار انتقال بیماری از نوجوانان و بزرگسالان به نوزادان و کودکان گسترش استراتژی واکسیناسیون از جمله ایمن سازی جهانی نوجوانان و بزرگسالان بخصوص، کارکنان بهداشت، پرستاران کودکان و والدین نوزادان، می ­تواند به کنترل بیماری سیاه سرفه کمک شایانی نماید. سیاه سرفه یک تهدید جدی برای نوزادان و کودکان و تا حد زیادی نوجوانان و بزرگسالان است از اینرو، افزایش آگاهی پزشکان با بیماری سیاه سرفه و روش های استاندارد تشخیص آن و عمل به استراتژی­ های مختلف واکسیناسیون برای افزایش کنترل این بیماری حائز اهمیت بود (۲۲).
درسراسر جهان، سالانه۵۰ میلیون مورد سیاه سرفه اتفاق می افتد که %۹۰ در کشورهای در حال توسعه می باشد. نوزادان، گروه آسیب پذیر با بالاترین میزان عوارض و مرگ و میرهستند، با این حال کودکان، نوجوانان و بزرگسالان در حال حاضر درصد قابل توجهی از موارد را تشکیل می دهند و یک منبع انتقال عفونت به نوزادان هستند.
PCR، کشت و سرولوژی روش­های اصلی تشخیص آزمایشگاهی سیاه سرفه بوده که عوامل مختلفی بر حساسیت و ویژگی هر یک از روش های مذکور مؤثر می باشد. با این حال، در سال­های اخیر، PCR به یک روش مناسب با تأثیر قابل توجه در افزایش تشخیص آزمایشگاهی سیاه سرفه تبدیل شده است (۲۲).
۱-۳٫ باکتریولوژی
عامل ایجاد کننده سیاه سرفه، یک باسیل کوچک گرم منفی و پلی مورف است (شکل۱-۱). اگرچه ارگانیسم صد سال پیش در ترشحات و نمونه های پاتولوژیک کودکان مبتلا به بیماری سیاه سرفه شناسایی شده بود ولی این ارگانیسم تا سال ۱۹۰۶ که بوردت (Bordet) و ژانگو (Gengou) با بهره گرفتن از محیط کشت مخصوص موفق به کشت آن در آزمایشگاه شدند، تکثیر نشده بود. هنوز در بسیاری از آزمایشگاه ها از محیط بوردت-ژانگو برای تکثیر این باکتری استفاده می نمایند.
تاکنون محیط های سنتتیک مختلفی برای رشد و تکثیر این باکتری برای تولید واکسن طراحی و بکار گرفته شده است (۱۸).
شکل۱-۱٫کوکوباسیل سیاه سرفه
دو ارگانیسم دیگر نیز در جنس بوردتلا به نام بوردتلا پاراپرتوسیس ^[۷]و بوردتلا برونشی سپتیکا^[۸] وجود دارد که پاراپرتوسیس مسئول سندرمی شبیه پرتوسیس در انسان است که معمولاً شدتش از پرتوسیس کمتر است. برونشی سپتیکا بیماریهای تنفسی در حیوانات خانگی را ایجاد می کند. چون ساختارهای DNA این دو ارگانیسم به طور ضروری همانند بوردتلا پرتوسیس است، ممکن است آنها در حقیقت سه ارگانیسم زیر گونه از یک باکتری یکسان باشند (۵۴و۱۰).
بین همه ی گونه های بوردتلا، فقط بوردتلا پرتوسیسPT را سنتز می کند. اگرچه کروموزوم بوردتلا پاراپرتوسیس و بوردتلا برونشیسپتیکا دارای لوکوس ژنPT است اما رونویسی آنها بدلیل پروموتور ناقص خاموش می باشد. در فاز حاد، هر سه ارگانیسم فاکتورهای ویرولانس مشابه ایجاد می کنند.
بعضی از تحقیقات عدم وجود اطلاعات در مورد این بیماری را تا قبل از قرن ۱۶ میلادی ناشی از سازگاری ارگانیسم­های حیوانی با انسان در ۵ قرن گذشته می­دانند. اگرچه شواهد اخیر نشان می­دهد که ارتباط بوردتلا پرتوسیس با انسان ها ممکن است قدیمی­تر از آنچیزی باشد که قبلاً تصور می شد (۵۴).
اخیراً سویه هایی از پرتوسیس شناسایی شده اند از جمله بوردتلا هولمسی^[۹] که در بیماران واجد نقص ایمنی^[۱۰] منجر به باکتریمی^[۱۱]، اندوکاردیت^[۱۲] و بیماری های تنفسی می گردد. سویه دیگر می توان از بوردتلا هینزی^[۱۳] نام برد که از خون بیمار مبتلا به ایدز و همچنین از ترشحات دستگاه تنفسی بیمار مبتلا به سیستیک فیبروزیس^[۱۴]جدا شده است. اگرچه بسیاری از فعالیت های بیولوژیکی بوردتلا پرتوسیس از مدت ها پیش مشخص شده بود اما تلاش ها برای یافتن ترکیبات مسئول هر یک از فعالیت های متنوع این ارگانیسم برای سال ها ناموفق باقی ماند. بهر حال وقتی ترکیبات و اجزای اختصاصی ارگانیسم مشخص شد نه تنها باعث افزایش درک پاتوژنیسیته بیماری شد بلکه در نهایت منجر به خالص سازی این اجزاء و تولید واکسن غیرسلولی سیاه سرفه^[۱۵] شد (۱۸).
بوردتلا پرتوسیس تمایل ویژه ای برای اتصال شدید به سلول های پوششی مژه دار^[۱۶] در مجاری تنفسی دارد. باکتری ممکن است وارد سلول های پوششی شود اما بطور معمول نمی تواند وارد سلول های غشاء پایه^[۱۷] شده و یا به داخل گردش خون تهاجم نماید (شکل۱-۲). به هر حال توکسین های تولید شده توسط باکتری می تواند به جریان خون وارد شده و عوارض سیستمیک را ایجاد نماید. آنتی ژن های بوردتلا پرتوسیس که در واکسن های غیر سلولی بکار می رود و همچنین سایر آنتی ژن های این باکتری در جدول ۱-۱ ذکر شده است (۱۸).
شکل۱-۲٫ اتصال بوردتلا پرتوسیس به سلول های پوششی مژه دار مجاری تنفسی
جدول ۱-۱ . آنتی ژن های مختلف باکتری سیاه سرفه