همزن برقی، مگنت، ترازوی دیجیتال، پیپت و پیپتور، ارلن استریل
پودر EDTA ، پودر Tris base، استیک اسید خالص[۵۵]، آب مقطر
۳-۵-۵-۲: روش تهیه بافر
مقدار ۳۰۰ میلی لیتر آب مقطر در یک بشر ریخته و به همراه یک مگنت روی دستگاه استیرر قرار داده شد.به ترتیب مقدار ۸۵/۱ گرم پودر EDTA ، ۲/۲۴ گرم پودر Tris base و۷/۵ میلی لیتر محلول استیک اسید خالص با احتیاط به آن اضافه شد.
حجم محلول توسط آب مقطر به ۵۰۰ میلی لیتر رسانده شد.
جهت تهیه ژل آگارز و همچنین بافر تانک الکتروفورز نیاز به بافر ۱X داریم. برای این منظور بافر ساخته شده توسط آب مقطر رقیق و استفاده شد .
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
۳-۵-۶: الکتروفورز محصول PCR
۳-۵-۶-۱: مواد و تجهیزات مورد نیاز
دستگاه الکتروفورز، سمپلر، دستگاه تابش [۵۶]UV، عینک محافظ، کَسِت ۳۰ میلی لیتری الکتروفورز
محلول SYBR safe، حامل رنگی[۵۷]، بافر TAE1X، پودر آگارز،
۳-۵-۶-۲: تهیه ژل آگارز جهت الکتروفوز
برای تهیه ۳۰ میلی لیتر ژل آگارز %۲ مقدار۶۶/۰ گرم پودر آگارز در ۳۰ میلی لیتر بافر TAE 1X حل شد.
محلول تا زمان جوشیدن حرارت داده شد.
پس از سرد شدن در دمای محیط داخل کست ۳۰ میلی لیتری الکتروفورز ریخته شد.
کست حاوی ژل پس از سرد شدن داخل تانک الکتروفورز با بافر TAE1x قرار داده شد.
۳-۵-۶-۳: روش الکتروفورز محصول PCR
µl5 از هر محصول PCR با lµ۱ از محلول حامل رنگی[۵۸] توسط سمپلر مخلوط شده و درون چاهک ژل از پیش تهیه شده ریخته شد.
دستگاه الکتروفورز با ولتاژ ۸۰ به مدت ۶۰ دقیقه ران شد.
ژل از کست جدا شده و به مدت ۱۵ دقیقه در محلول SYBR safe غوطه ور شد تا کاملا رنگ آمیزی شود.
سپس ژل زیر اشعه دستگاه تابش UV بررسی و از آن عکس برداری شد.
۳-۶: استخراج PRP
۳-۶-۱: مواد و تجهیزات مورد نیاز
انکوباتور شیکر دار، دستگاه سانتریفیوژ، سمپلر، فالکون استریل،
محیط کشت مایع BHI+supplement، محلول NaCl 0.4 m، محلول CTAB، اتانول ۹۵%
۳-۶-۲: تهیه ml50 محلول CTAB 0.5 M
وزن مولکولی CTAB 45/3644 است. برای تهیه ۵۰ میلی لیتر CTAB 0.5 M مقدار ۱۱/۹ گرم از پودر CTAB محاسبه شده و توسط ترازوی دیجیتال وزن شده و در۴۰ میلی لیتر آب مقطر ریخته شد.
برای حل شدن کامل پودر محلول تا زمان شفاف شدن حرارت داده شد.
محلول به دست آمده توسط آب مقطر به حجم ۵۰ میلی لیتر رسانده شد
۳-۶-۳: تهیه ml 50 محلول NaCl 0.4 M
وزن مولکولی NaCl 44/58 است. پس برای تهیه ml 50 محلولM 4/0 مقدار ۱۶/۱ گرم محاسبه شده و توسط ترازوی دیجیتال وزن شد، و در ۴۰ میلی لیتر آب مقطر حل شد.
محلول به دست آمده توسط آب مقطر به حجم ۵۰ میلی لیتر رسانده شد.
۳-۶-۴: روش استخراج PRP
µl 100 از سوش باکتری پس از یخ زدایی به ml 30 محیط BHI + supplement اضافه شد
به مدت ۱۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه به همراه ۵% Co2 و شیکینگ rpm 150 انکوبه شد.
ml 30 از نمونه در دمای ۴ درجه به مدت ۳۰ دقیقه با دور rpm 5000 سانتریفیوژ شد.
ml 25 از محلول رویی (سوپرناتانت) جدا شد.
ml 12.5 از محلولM 5/0 CTAB به سوپرنیت اضافه شد
به مدت ۶۰ دقیقه در دمای اتاق و شیکینگ با دور ۱۵۰ rpm انکوبه شد.
سپس ۲۰ دقیقه در دمای ۲۲ درجه و با دور rpm 5000 سانتریفیوژ شد.
محلول رویی تخلیه شد.
رسوب باقی مانده در ml NaCl 0.4 M 5 حل شد
ml 15 اتانول ۹۵% به آن اضافه شد.
محلول به مدت ۶۰ دقیقه در دمای اتاق و شیکینگ با دور ۱۵۰ rpm انکوبه شد.
۱۰ دقیقه با دور rpm5000 در دمای ۲۲ درجه سانتریفیوژ شد.
محلول رویی تخلیه شد.
