فسفر:
فسفر در فسفریلاسیون نوری، مسیر پنتوز فسفات و گلیکولیز و یا به عبارت دیگر در چرخه­های متابولیکی که به ATP و NADPH مربوط می­ شود، نقش مهمی دارد. فسفر عضو مهم غشاهای بیولوژیکی (در فسفولیپیدها) و اسیدهای نکلوئیک است. در گیاهانی که دارای کمبود فسفر هستند. تحرک نشاسته به رگبرگ­های آن­ها خسارت وارد می­ کند. در چنین گیاهانی نشاسته به مقدار زیاد در کلروپلاست­ها تجمع می­یابد. وجود فسفر در محیط کشتی که دارای سطح بالای فسفات معدنی است، مانع سنتز بیولوژیکی اتیلن^[۹۲] می­گردد. در محیط کشت دارای آگار، میزان فسفر قابل دسترس به دلیل جذب توسط آگار کاهش می­یابد (ادوین، ۲۰۰۸).
۱-۶-۱-۳- عامل ژلی:
آگار^[۹۳] گران­ترین ترکیب در محیط کشت جامد می­باشد. آگار قابل حل به صورت ژل در می ­آید که قادر به جذب آب می­باشد. نوع آگار مورد استفاده می ­تواند بر روی آزمایش­های کشت بافت تاثیر بگذارد. متخصصین کشت بافت گیاهی اغلب از آگار دیفکو-باکتو با غلظت ۶/۰ تا ۸/۰ درصد استفاده می­ کنند اگر چه سایر انواع آگار (گیبکوفیت آگار، فلوآگار و غیره) نیز مورد استفاده قرار می­گیرند (ادوین، ۲۰۰۸).
۱-۶-۱-۴- ویتامین­ها:
ویتامین­ها دارای وظایف کاتالیزوری در واکنش­های آنزیمی می­باشند. ویتامین­ها دارای اهمیت زیادی در کشت سلولی می­باشند. از جمله ویتامین­های مورد استفاده در کشت بافت می­توان از تیامین (B₁)، کلسیم پانتوتنات یا اسید پانتوتنیک، اسید فولیک (ویتامین M)، ریبوفلاوین (لاکتوفلاوین، ویتامین B₂)، اسید اسکوربیک (ویتامین C)، اسید نیکوتنیک (ویتامین PP، نیاسین)، پیرودوکسین (آدرمین، ویتامین B₆)، بیوتین (ویتامین H)، پاراآمینواسید بنزوئیک، توکوفرول (ویتامین E) و اینوزیتول (میواینوزیتول، مزواینوزیتول) نام برد (ادوین، ۲۰۰۸).
۱-۶-۱-۵- تنظیم کننده­ های رشد گیاهی:
نوع و غلظت تنظیم کننده­ های رشد گیاهی مورد استفاده در کشت­بافت بر حسب کشت سلولی تغییر می­ کند. مواد تنظیم کننده رشد گیاهی را می­توان به پنج گروه اکسین­ها، جیبرلین­ها، سیتوکینین­ها، بازدارنده­های رشد و اتیلن تقسیم ­بندی نمود (کریکوریان، ۱۹۹۵).
اکسین­ها:
اکسین­ها طیف وسیعی از عکس­العمل­های رشد را باعث می­شوند. اکسین­ها معمولا باعث رشد طولی ساقه، تورم بافت­ها، تقسیم سلولی (تشکیل کالوس) و تشکیل ریشه ­های نابجا و ممانعت از تشکیل شاخه­ های نابجا و جانبی می­شوند و غالبا رویان­زایی را تحریک می­ کنند. در غلظت کم اکسین، تشکیل ریشه ­های نابجا، حالت غالب دارد در حالی که در غلظت زیاد اکسین تشکیل ریشه صورت نمی­گیرد و تشکیل کالوس اتفاق می­افتد (بلارمینو و همکاران، ۱۹۹۴).
سیتوکینین­ها:
این گروه شامل سیتوکینین­های طبیعی ۲- ایزوپنتنیل آدنین^[۹۴] (۲ip) و زآتین و سیتوکینین مصنوعی کینتین و بنزیل آمینو پورین^[۹۵] (BAP) هستند. سیتوکینین­های مصنوعی، فعالیت بیولوژیکی بسیار بالا دارند و گران نیستند، لذا کاربرد وسیعی در کشت بافت دارند. سیتوکینین­ها باعث تورم بافت­ها، تحریک نمو جوانه­های جانبی و نابجا و تحریک تقسیم سلولی می­شوند. در کشت بافت گیاهی، نقش سیتوکینین­ها در تحریک نمو جوانه جانبی از طریق کاهش غالبیت انتهایی بسیار با اهمیت است. سیتوکینین­ها در حضور گرما پایدار هستند و ممکن است که قبل از اتوکلاو کردن به محیط کشت اضافه شوند (معینی و کهریزی، ۱۳۸۲).
جیبرلین­ها:
در بین انواع جیبرلین­ها، GA₃ بیشتر از همه مورد استفاده قرار می­گیرد (اسکاتلند^[۹۶] و لنگیل^[۹۷]، ۱۹۹۸) جیبرلین­ها نیز علاوه بر افزایش رشد طولی ساقه­ها، باعث کاهش میزان غده­زایی در سیب­زمینی می­شوند (بابر^[۹۸] و جین^[۹۹]، ۱۹۹۸).
۱-۵-۱- عوامل فیزیکی موثر بر کشت بافت:
عوامل فیزیکی شامل نور (شدت و مدت)، دما، pH، رطوبت، قابلیت دسترسی به آب (اسمولاریته محیط کشت)، میزان اکسیژن قابل دسترسی، میزان گاز کربنیک موجود در فضای کشت و هم­چنین میدان­های الکتریکی، عوامل جوی و فضایی مثل پرتوها، امواج صوتی و الکترومغناطیس (ادوین وهمکاران، ۲۰۰۸). pH مناسب برای رشد و کشت بافت گیاهی معمولا در محدوده ۵٫۵ تا ۶ می­باشد. در pH بالاتر از ۶، ژل سفت و سخت می­ شود (بلارمینو و همکاران، ۱۹۹۴).

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

در رابطه با نور باید سه عامل طول روز، شدت نور و ترکیب آن را در نظر گرفت. در رابطه با تاثیر طول روز در کشت درون شیشه ­ای اطلاعات کمی موجود است. معمولا طول روز بین ۱۴ تا ۱۶ ساعت در نظر گرفته شده ولی نور مدوام هم به کار رفته است. البته در موارد بسیار خاص، رشد در تاریکی مداوم هم اتفاق افتاده است. غالبا در کشت بافت از میزان تشعشع پایین استفاده می­ شود (اسکاتلند و لانگیل، ۱۹۹۸).
۱-۶-۱- تاثیر مواد گیاهی بر کشت بافت:
ریزنمونه قطعه­ای از بافت گیاهی است که در محیط کشت قرار می­گیرد. انتخاب ریزنمونه مناسب در کشت بافت گیاهی از اهمیت زیادی برخوردار است. عوامل زیادی در انتخاب ریزنمونه مناسب دخالت دارند.
در کشت میزان موفقیت در ریزنمونه­هایی که از جوانه­های انتهایی گرفته شده بیشتر از جوانه­های جانبی است (سنِویرات­نی^[۱۰۰] و همکاران، ۱۹۹۸). به نظر می­رسد که قدرت رشد جوانه­های انتهایی نسبت به جوانه­های جانبی بیشتر بوده و استفاده از ریزنمونه­های انتهایی در اغلب کشت­ها مناسب­تر است.
سن ریزنمونه در انتخاب ریزنمونه مناسب اهمیت زیادی دارد. بافت­های جوانتر معمولا در محیط درون شیشه ­ای زودتر پاسخ می­ دهند (اسمیت^[۱۰۱] و درو^[۱۰۲]، ۱۹۹۰).
فصلی که ریزنمونه از گیاه جدا می­ شود نیز بر روی پاسخ ریزنمونه به کشت بافت موثر است. به عنوان مثال، جوانه­ ها یا ساقه­های گرفته شده از گیاه در فصل بهار که گیاه در حال رشد است، پاسخ خوب و سریعی به کشت بافت نشان می­ دهند (اسمیت و درو، ۱۹۹۰).
اندازه ریزنمونه نیز تاثیر مهمی در کشت بافت دارد. عموما القا رشد در ریزنمونه­های کوچک­تر نسبت به ریزنمونه­های بزرگ­تر مشکل­تر است. ریزنمونه­های گرفته شده از گیاهان سالم نسبت به گیاهانی که تحت تنش مواد غذایی و آبی بوده یا در معرض عوامل بیماری­زا می­باشند، مفیدتر هستند. هم­چنین نوع گونه گیاهی تاثیر مهمی در پاسخ به کشت بافت گیاهی دارد. معمولا کشت بافت در گیاهان دولپه­ای نسبت به گیاهان تک لپه­ای با موفقیت بیشتری همراه است (موحدی، ۱۳۹۰).
۱-۷-۱- تولید غده^[۱۰۳]:
با توجه به این­که هدف اصلی کاربرد کشت بافت، بهبود تولید سیب­زمینی در سطح مزرعه است، بنابراین کلیه روش­های به کار رفته باید توانایی خود را در شرایط مزرعه به اثبات برسانند. بطور مثال، در روش­های مختلف تکثیر نهایتا به گیاهچه می­رسیم این گیاهچه بایستی بتواند در شرایط مزرعه رشد کرده و نهایتا تولید غده کند. ولی به دلیل این­که گیاهچه در شرایط کنترل شده از نظر نوری و حرارتی رشد کرده، توانایی تحمل نوسانات شرایط محیطی را ندارد و در نتیجه اگر بلافاصله گیاه به شرایط مزرعه منتقل شود، سریعا از بین می­رود، بنابراین نشاء کردن گیاهچه در شرایط مزرعه بدون این که تدریجا با شرایط محیطی سازگاری پیدا کند، بی نتیجه خواهد بود (وانگ و هو، ۱۹۸۵).
در طی چند سال اخیر توجه زیادی به تولید غده در شرایط درون شیشه شده است و تا کنون تحقیقات وسیعی در ابعاد مختلف، جهت رسیدن به شرایط ایده­آل انجام گرفته است.
مزایای تولید غده در شرایط درون شیشه عبارتند از:

• • امکان انتقال مستقیم ریزغده از آزمایشگاه به مزرعه (آکیتا و تاکایاما، ۱۹۹۴).

• • به دلیل این­که غده­ها دارای رکود هستند، ذخیره­سازی و ارسال آن­ها به سهولت انجام می­ شود (وانگ و هو، ۱۹۸۵).

• • تولید غده می ­تواند به مقدار زیاد و بدون در نظر گرفتن فصل خاصی انجام گیرد (باجاج و ساپوری، ۱۹۸۸).

• • در صورتی که غده­ها از گیاهچه­های عاری از بیماری بدست آیند، از نظر قوانین قرنطینه بین ­المللی، ارسال آن­ها با مشکل مواجه نخواهد بود (دادس^[۱۰۴]، ۱۹۸۸).

• • برای ارسال مواد گیاهی به سایر نقاط، اگر مرحله ترانزیت به تاخیر بیافتد، در صورتی که ماده ارسالی غده باشد، در کیفیت رشد بعدی آن افتی ایجاد نخواهد شد (دادس، ۱۹۸۸).

• • جهت حفظ ژرم­پلاسم نیاز به کشت مجدد در محیط کشت جدید نیست (هوسی^[۱۰۵] و استیسی^[۱۰۶]، ۱۹۸۴).

• • سازگاری بیشتر با انواع ماشین­های کشت مکانیزه دارد (هوسی و استیسی، ۱۹۸۴).

بنابراین، با توجه به مزایای ذکر شده، از این روش می­توان جهت حفظ ژرم­پلاسم و انتقال سریع نتایج آزمایشگاهی به مزرعه استفاده نمود.
فصل دوم
مروری بر تحقیقات انجام شده
با توجه به این­که سیب­زمینی دارای تکثیر رویشی می­باشد، بنابراین گیاهان حاصل از تکثیر آن از نظر ژنتیکی با گیاه منشاء خود تفاوتی ندارند. به همین دلیل در کاربرد روش­های کشت­بافت و تکثیر سیب­زمینی بایستی از روش­هایی که تنوع ژنتیکی ایجاد نمی­کند استفاده کرد. یکی از روش­هایی که دارای خصوصیت فوق باشد، روش کشت قلمه­های ساقه و رشد جوانه­های جانبی در محیط کشت مصنوعی (درون شیشه) است. اکثر محققین جهت تکثیر کلون­های سیب­زمینی از این روش استفاده می­ کنند ولی شرایط و نوع استفاده ممکن است در بررسی­های مختلف متفاوت باشد. در ادامه مطلب به بررسی برخی از آن­ها و نتایج حاصله اشاره می­ شود.
لاوارنس^[۱۰۷] و بارکر^[۱۰۸] (۱۹۶۳) از جوانه­های جانبی رویشی که در شرایط تاریکی رشد کرده بود، استفاده کرده و آن­ها را در محیط کشت وایت همراه با ۵/۲ میلی­گرم در لیتر کلسیم پانتوتنات کشت دادند. هدف آن­ها از این آزمایش مطالعه درجه حرارت­های مطلوب، فتوپریود مناسب و غلظت­های مختلف ساکارز بود. نتیجه­ای که در این آزمایش حاصل شد به این صورت اعلام گردید که جهت غده زایی، استفاده از ساکارز در غلظت ۸% و روشنایی متوسط یا تاریکی مناسب­تر است. هم­چنین فتوپریودهای ۸، ۱۶ و ۲۴ ساعت روشنایی برای غده زایی مطلوب نیست.
هارمی^[۱۰۹] و همکاران در سال (۱۹۶۶) بیان کردند که افزودن تنظیم کننده­ های رشد تنها در صورتی نمو ریز­غده­ها را افزایش می­دهد که ساکارز کافی (۸%) تامین باشد.
در آزمایشی که روکا^[۱۱۰] و همکاران (۱۹۷۸) روی تکثیر ارقام سیب­زمینی انجام دادند، تکثیر مواد گیاهی در دو مرحله انجام شد. در مرحله اول از ساقه گیاهان عاری از عوامل بیماری­زا، قلمه­های تک جوانه برش زده و در محیط کشت پایه MS که با ۳% ساکارز و ۲ میلی­گرم در لیتر کلسیم پانتوتنات و هورمون­های NAA و BAP و GA₃ تکمیل شده بود، کشت دادند. سپس ظروف کشت شده در دمای ۲۴-۲۲ درجه سانتی ­گراد و شدت نور ۱۰۰۰ لوکس و فتوپریود ۱۶ ساعته قرار گرفتند.
در مرحله دوم، از گیاهچه­های حاصل از مرحله قبل، قطعاتی را برش زده و درون فلاسک­های ۱۲۵ میلی­لیتری محتوی ۱۵ میلی­لیتر محیط غذایی کشت شدند. جهت رشد جوانه­های جانبی کشت­ها را روی دستگاه شیکر با ۹۰ دور در دقیقه با فتوپریود و درجه حرارت مشابه مرحله قبل ولی شدت نور ۲۰۰۰ لوکس که توسط لامپ­های فلورسنت ۴۰ وات ایجاد می­شد، قرار دادند. آن­ها از این آزمایش چنین نتیجه گرفتند که استفاده از روش فوق بیشترین ثبات ژنتیکی را در گیاهان حاصل از تکثیر ایجاد می­ کند.
وانگ و هو در سال (۱۹۸۲) آزمایشی با هدف تولید انبوه غده سیب­زمینی به روش درون شیشه انجام دادند. آن­ها جهت تکثیر از مواد گیاهی عاری از ویروس حاصل از کشت مریستم استفاده کردند و برای تولید غده، گیاهچه­های عاری از ویروس را در یک محیط مایع محتوی محیط پایه MS همراه با BAP و ساکارز کشت نمودند. آن­ها در این تحقیق، روی مقادیر مناسب BAP و ساکارز مطالعه می­کردند و به این نتیجه رسیدند که شرایط مطلوب جهت غده زایی انبوه در شرایط درون شیشه استفاده از محیط کشت مایع MS محتوی ۱۰ میلی­گرم در لیتر BAP و ۸% ساکارز است. شرایط مطلوب جهت رشد را نیز دمای ۲۰ درجه سانتی ­گراد و فتوپریود ۸ ساعته با شدت نور ۱۰۰۰ لوکس تعیین کردند. در این تحقیق در مرحله غده زایی از فلاسک­های ۵۰۰ میلی­لیتری محتوی ۲۰۰ میلی­لیتر محیط کشت غده­زایی استفاده شد.
سنگر^[۱۱۱] و دینگرا^[۱۱۲] در سال (۱۹۸۴) جهت تکثیر مواد گیاهی حاصل از کشت مریستم با بهره گرفتن از روش کشت قلمه تک جوانه آزمایشی با هدف بدست آوردن گیاهچه­های زیاد با ساقه و ریشه ­های قوی انجام دادند. در این آزمایش از غلظت­های مختلف NAA در محیط کشت استفاده شد. در پایان چنین نتیجه گیری شد که غلظت ۵/۰ میلی­گرم در لیتر NAA بهترین غلظت جهت رشد ساقه و ریشه قوی گیاهچه­ها است.در این آزمایش گیاهچه­ها در شرایط نوری ۲۰۰۰ لوکس و فتوپریود ۱۶ ساعته و دمای ۲±۲۵-۲۰ درجه سانتی ­گراد قرار گرفته بودند.
هوسی و استیسی (۱۹۸۴) با آزمایشی که بر روی فاکتورهای موثر بر غده­زایی سیب­زمینی در شرایط درون شیشه انجام دادند چنین نتیجه گرفتند که غده­زایی در محیط کشت دارای ۲ میلی­گرم در لیتر BAP و ۶% ساکارز و در فتوپریود ۸ و ۲۴ ساعته انجام می­گیرد. اما اثر تحریک کنندگی BAP در شرایط روز کوتاه بیشتر از روز بلند می­باشد. هم چنین افزودن کلروکلین کلراید^[۱۱۳] (CCC) به تنهایی باعث کاهش غده­زایی نسبت به حالتی که همراه با BAP در محیط کشت باشد می­گردد. ABA دارای اثر کم و GA₃ دارای اثر بازدارندگی بر روی غده­زایی است و نیز با بستن درب ظروف کشت، غده زایی محدود می­ شود ولی اگر از مواد جذب کننده اتیلن مثل زغال فعال^[۱۱۴] استفاده شود تاثیری نخواهد داشت.
این محققین هم­چنین محیط مناسب برای ریز­غده­زایی را محیط MS دارای ۲ میلی­گرم در لیتر BAP و ساکارز ۶% و دوره­ نوری ۸ ساعتی بیان کردند. هم چنین نشان دادند زمانی که BAP و CCC تامین باشد ساکارز ۶% برای غده­زایی بهینه است.
اسکیلد-رنت­اسکلر و اسکمیدیش در سال (۱۹۸۴) از محیط­های MS دارای سایتوکینین ۱۴-۱۰ میلی­گرم در لیتر و ساکارز ۶ تا ۸% برای ریز غده­زایی استفاده کردند و دریافتند در صورت عدم استفاده از سیتوکینین به عنوان محرک غده­زایی می­بایست از دوره­ های نوری بلند با شدت زیاد و در صورت استفاده از سیتوکینین می­بایست از دوره کوتاه نوری با شدت کم و یا تاریکی پیوسته استفاده کرد.
وانگ و هو در سال (۱۹۸۵) در آزمایشات خود جهت تولید گیاهچه حاصل از ساقه، ابتدا غده­ها را با آب معمولی شسته سپس در محلول هیپوکلریت کلسیم^[۱۱۵] ۱% به مدت ۱۰ دقیقه خیسانده و بعد با آب مقطر استریل شستشو دادند. پس از ضدعفونی، جهت شکستن رکود جوانه­ ها غده­ها را به مدت یک ساعت در محلول ۰۳/۰ میلی­مول GA₃ فرو برده سپس بر روی کاغذ صافی قرار دادند و در زمان­های مختلف با محلول یک میلی­مول کلرید کلسیم آن­ها را مرطوب می­کردند. جهت رشد ساقه، غده­ها را در حرارت ۱۸ درجه سانتی ­گراد قرار داده و پس از رشد آن­ها را به قطعاتی که دارای یک جوانه جانبی باشد، تقسیم کردند. برای کشت قطعات سیب­زمینی از محیط کشت MS محتوی ۱/۰ میلی­گرم در لیتر GA₃ و ۳% ساکارز استفاده شد. سپس جهت رشد در فتوپریود ۱۶ ساعته با شدت نور ۴-۳ کیلولوکس و دمای ۲۵-۲۲ درجه­سانتی ­گراد قرار گرفتند.
تاور و همکاران در سال (۱۹۸۵) روش جدیدی جهت تولید غده در شرایط درون شیشه ارائه کردند. آن­ها در این روش از ۳ مرحله استفاده کردند: